лібаева Эльмира Траызы Елтірі тымдас ойларды прионды ге

ӘОЖ 636.32:38.636.03 Қолжазба құқында

ӘЛІБАЕВА ЭЛЬМИРА ТҰРАҚҚЫЗЫ

Елтірі тұқымдас қойлардың приондық генотиптерін

селекциялық-биотехнологиялық бағалау

06.02.01 — Ауыл шаруашылығы малын өсіру, олардың селекциясы,

генетикасы және көбеюі

ауыл шаруашылығы ғылымдарының кандидаты

ғылыми дәрежесін алу үшін дайындалған диссертация

АВТОРЕФЕРАТЫ

Қазақстан Республикасы

Шымкент, 2009

Жұмыс «Оңтүстік-Батыс мал және өсімдік шаруашылығы ғылыми-зерттеу институты» ЖШС-де орындалған

Ғылыми жетекшісі: Ауыл шаруашылығы ғылымдарының докторы,

профессор, ҚР мемлекеттік сыйлығының лауреаты

Әлібаев Н.

Ресми оппоненттері: Ауыл шаруашылығы ғылымдарының докторы,

профессор Рүстенов А.

ауыл шаруашылығы ғылымдарының кандидаты,

доцент Жолшыбек Т.

Жетекші ұйым: «Мал шаруашылығы және ветеринария

ғылыми-өндірістік орталығы»ЖШС

Қорғау «__28__» __ақпан__ 2009 жылы сағат 1000-де «Оңтүстік-Батыс мал және өсімдік шаруашылығы ғылыми-зерттеу институты» ЖШС-нің Д.55.39.01. диссертациялық кеңесінде өтеді. Мекен-жайы: 160019, Шымкент қаласы, Әл-Фараби алаңы, 3.

Диссертациямен «Оңтүстік-Батыс мал және өсімдік шаруашылығы ғылыми-зерттеу институты» ЖШС-нің кітапханасында танысуға болады.

Автореферат «_____» ________________ 2009 жылы таратылды.

Диссертациялық кеңестің

ғалым хатшысы, ауыл шаруашылығы

ғылымдарының докторы, профессор М.Есқара

КІРІСПЕ

Зерттеудің өзектілігі. Еліміздің шөл және шөлейт аймақтарына жақсы бейімделген бірнеше қой тұқымдары: қаракөл, атырау және қазақтың құйрықты қойлары тиімді өсірілуде. Еуропалық мал шаруашылығы ассоциациясының мәліметі бойынша дүние жүзіндегі өндірілетін мал өнімдерінің 20-25% әртүрлі мал ауруларының салдарынан жоғалып отыр.

Қазіргі кезде баяу қозатын инфекциялық топқа жататын мал ауруларының бір түрі – скрепи. Осы уақытқа дейін аурудың таралу механизмі белгісіз, оның ауру малдан сау малға және адамға жұғатыны мәлім. Негізінен ауру малға енесінің сүтінен, эмбриондарды трансплатациялаудан және мал азығынан жұғады. Патогенді ақуыз қан құрамына еніп, алғашында жасушаларды, содан кейін бүкіл ағзаны жансыздандырып, соңынан мал өліміне әкеліп соқтырады. Сондықтан көптеген елдерде малдарды патогенді ақуыздарға төзімділігі бойынша генетикалық сертификациялауға және бұл мәселені шешуге мемлекеттік тұрғыдан ерекше көңіл бөлінуде. Америка мен еуропа елдерінде малдарды міндетті түрде сертификациялау жүктелген. Еуропалық одаққа кірген мемлекеттерде бағдарлама қабылданып, онда скрепи ауруына қойлардың төзімділігін алдын ала анықтау үшін генетикалық мониторинг жүргізу міндеттелген. Малдарды генодиагностикалау Ресей Федерациясында ең қажетті технологиялар тізіміне кіргізілді. Осы кезге дейін біздің елімізде ауыл шаруашылығының генофондындағы малдар геномының көптүрлілігін, өнімділігін, сыртқы ортаға бейімделу қасиетін және әр түрлі ауруларға төзімділігін сипаттайтын генетикалық сертификаттар жасалмаған.

Биотехнологияның бүгінгі жетістіктері ауыл шаруашылық малдарының генетикалық диагностикалаудың көптүрлігін анықтауға және жүйесін жасауға мүмкіндік беріп отыр. Ал бұл саладағы іс жүзіндегі табыстар ауыл шаруашылық малдарын биотехнологиялық әдістемелер арқылы мал басын сақтауға, өнімділігін генетикалық тұрғыдан жетілдіруге және мал тұқымын жедел көбейтуге болатындығын шындыққа айналдырды.

Қазіргі кезде малдың өнімділік белгілеріне және инфекциялық ауруға төзімді генотиптерді анықтап, оларды мал шаруашылығының генетикалық мүмкінділігін жоғарылатуда пайдалануға ерекше мән беріп отыр.

Осыған байланысты малдарды молекулалық-генетикалық бағалаудың кешенді жүйесін жасау және оны мал шаруашылығы тәжірибесіне енгізу қазіргі күннің өзекті мәселесі.

Ғылыми-зерттеу жұмыстары «Оңтүстік-Батыс мал және өсімдік шаруашылығы ғылыми-зерттеу институтының» қолданбалы ғылыми — зерттеу жұмыстарының 07.02.01.06.Ж. «Елтірі бағытындағы қой тұқымдарының генетикалық құрылымының биотехнологиялық негізін ДНҚ-технология әдістемелері арқылы жасау» тақырыбына сәйкес орындалды. Мемлекеттік тіркеу нөмірі 0106 РК 01103.

Зерттеудің мақсаты мен міндеті. ДНҚ-технология әдістемесін қолдану арқылы елтірі тұқымдас қойларды приондық генотиптері бойынша жіктеу және оларға селекциялық- биотехнологиялық тұрғыдан баға беру.

Алға қойылған мақсатты орындау үшін төмендегідей міндеттер қойылды:

- елтірі тұқымдас қойлардың скрепи ауруына төзімділік деңгейін ДНҚ-генодиагностикалау әдістемелері арқылы анықтау;

- приондық протеин гендері әртүрлі қойлардың өнімділік деңгейін селекциялық тұрғыдан талдау;

- генотипі әртүрлі саулықтарды донор ретінде пайдаланып биотехнологиялық баға беру;

- зерттеудің экономикалық тиімділігін сараптау.

Зерттеудің ғылыми жаңалығы. Алғаш рет елтірі қой шаруашылығына қойлардың скрепи ауруына төзімділігін анықтау үшін генодиагностика тәсілі ұсынылды және пиросеквенирлеу технологиясын қолдану арқылы скрепиге генетикалық төзімділігі 4 класқа жататын (G1-G3 және Gx) 7 генотип анықталды.

Зерттеу нәтижесінде төмендегідей мәселелер шешімін тапты:

- ДНҚ-технология әдістемелерін қолдану арқылы қойлар популяциясын генодиагностикалаудың, мал шаруашылығы селекциясында және биотехнологияда пайдаланудың тиімді екендігі дәлелденді;

- оңтүстікте өсіріліп жатқан қойлар генотиптерінің скрепи ауруына генетикалық тұрғыдан төзімділігі жоғары екендігін генодиагностикалаудың нәтижелерін талдау арқылы белгілі болды;

- елтірі тұқымдас қойларды және тұқымішілік популяцияларды генотиптеу нәтижесінде, олардың біркелкілігі және генетикалық алшақтығы анықталды;

- приондық генотиптері әртүрлі саулықтардың елтірі сапасы, өсіп-дамуы және кейбір биологиялық ерекшеліктері зерттелінді;

- қой тұқымдарын асылдандыру және өнімділігін арттыруда фенотиптік приондық генотиптерді пайдалану тиімділігі дәлелденді;

- донор-саулықтардың суперовуляциялану деңгейіне олардың приондық генотиптеріне қарағанда гормональды статустарының әсері жоғары деңгейде болатындығы белгілі болды;

- елтірі тұқымдас қойларды приондық генотиптері бойынша бағалаудың селекциялық және экономикалық тиімділіктері анықталды.

Зерттеудің маңыздылығы. Жүргізілген зерттеу елтірі тұқымдас қойлардың өнімділігін фенотиптік белгілер арқылы жетілдірумен қатар, олардың елтірі-ет-май өнімділігін бірдей жақсарту үшін генотиптері бойынша сұрыптаудың жаңа генодиагностикалау әдістемесі ұсынылды. Атырау қой тұқымын генотиптеу арқылы олардың ішінен елтірілік сапасы және ет-май өнімділігі жоғары және генетикалық потенциалы тұрақты топ жасалды.

Зерттеу нәтижелерінің қолданбалы құндылығы мен жүзеге асырылуы.

Елтірі тұқымдас қойлар популяциясына генодиагностикалау әдістемесін қой басын көбейту және сақтау бағдарламасына қолданудың құндылығы төмендегідей:

- генотипі «ARR/ARR» саулықтарды селекцияда пайдалану ет өнімін өндірудің тиімділігін 53,8%, ал генотипі «ARQ/ARQ» саулықтар жоғарғы класты ұрпақтар үлесін 96,8% жеткізіп, елтірі өнімін өндірудің тиімділігін 40,5%-ға арттырады;

- елтірі тұқымдас қойларды генодиагностикау арқылы приондық генотип-терге жіктеп, оларды биотехнологияда донор ретінде пайдалану эмбриондарды трансплантациялау технологиясының тиімділік деңгейін 42,9%-дан 63,4%-ға дейін жоғарылатады.

Қорғауға ұсынылған негізгі мәселелер.

- елтірі тұқымдас қойлар популяциясын генодиагностикалау нәтижелері;

- генотиптері әртүрлі қойлардың елтірілік белгілері және өсіп-дамуы;

- генотиптері әртүрлі саулықтардың гормональдық статустары және

суперовуляциялану деңгейі;

- донор-саулықтардың эмбриондарының сапасы;

- зерттеудің экономикалық тиімділігі.

Жұмыстың сынақтан өтуі және жариялануы. Диссертациялық жұмыстың нәтижелері халықаралық ғылыми-практикалық конференцияларда: «Шоқан тағылымы-12» //Халықаралық ғыл.-практ.конф.материалдары (Көкшетау, 2007 ж.); Жас ғалымдардың ғылымға қосар үлесі //Республикалық ғыл.-өнд.конф.тезистері (Шымкент, 2007 ж.); Қазақстандағы қаракөл шаруашылығының тарихы және болшағы //Халықаралық ғыл.-өнд.конф.материалдары (Шымкент, 2008 ж.); Агроөндірістік кешеннің және қоршаған ортаның экологиялық проблемалары //V-і халықаралық конф.материалдары (Қызылорда, 2008 ж.) және Оңтүстік-Батыс мал және өсімдік шаруашылығы ғылыми-зерттеу институтының ғылыми кеңестерінде (2006-2008жж.) және биотехнология және иммуногенетика бөлімінің кеңейтілген мәжілісінде (2008ж.) талқыланған.

Диссертация тақырыбы бойынша жарық көрген мақалалар саны 10, оның ішінде 7-і ғылыми-тәжірибелік конференциялардың жинақтарында.

Жұмыстың құрылымы мен көлемі. Диссертациялық жұмыс материалдары 109 бетке компьютерлік мәтінмен терілген, 32 кестеден тұрады және 9 суретпен көмкерілген. Жұмыс, құрылымы бойынша, кіріспеден, әдебиетке шолудан, әдістемеден, зерттеу нәтижелерінен және қорытындылар мен ұсыныстардан, пайдаланылған әдебиеттер тізімі (147) мен қосымшалардан тұрады.

2 ЗЕРТТЕУ ЗЕРЗАТЫ МЕН ӘДІСТЕМЕСІ

2.1 Зерттеу зерзаты

Зерттеу жұмыстары 2006-2008 жылдар аралығында «Оңтүстік-Батыс мал және өсімдік шаруашылығы ғылыми-зерттеу институты» және «Бүкілресейлік мал шаруашылығы ғылыми-зерттеу институтының» зертханаларында жүргізілді.

Жалпы зерттеу жұмыстары 3 кезеңнен тұрады: І-тұқымы елтірі тұқымдас қойлар ұрпақтарын генодиагностикалау және генотиптеу; ІІ-генотипі әртүрлі қозылардың селекциялық және биологиялық құндылығын анықтау; ІІІ- генотипі әртүрлі саулықтардың биотехнологиялық және экономикалық тиімділігін анықтау.

Жүргізілген тәжірибе жұмыстарының жалпы сызбанұсқасы 1-суретте берілген.

Зерттеу зерзаты ретінде Оңтүстік-Батыс мал және өсімдік шаруашылығы ғылыми-зерттеу институтының «Селекциялық-генетикалық орталығында» өсіріліп жатқан 2 қой тұқымы тобы іріктелініп алынды. Бірінші тәжірибе топ-149 бас әртүсті қаракөл қой тұқымы. Бұл қойлар түсі бойынша былай бөлінеді: қара – 30 бас, көк – 30 бас, бұқар сұры – 30, қазақ сұры – 30 бас, қарақалпақ сұры – 29 бас; екінші тәжірибе топ – 30 бас өнімі елтірі және етті-майлы атырау құйрықты қой тұқымы; ал үшінші салыстырмалы топ – 29 бас қазақтың құйрықты қой тұқымы.

Зерттеу нысаны ретінде әр тұқымды қойлар ұрпақтарының құлақ ұлпасынан бөлініп алынған ДНҚ пайдаланылды.

Биологиялық үлгілерді алу және сақтау. Тәжірибеге генодиагностикалау арқылы генотиптеу үшін 208 бас әр қой тұқымдары қозыларынан туылған кезінде құлақ қалқаны ұлпасынан үлгілер алынды. Алынған ұлпа үлгісі 100% этил спирті толтырылған 1,5 мл арнайы түтікшеге салынып, +40С температурада зертханаға жеткізіліп сақталды.

ДНҚ бөліп алу. ДНҚ бөліп алуға арналған реагенттер:

ACD ерітіндісі (+40С температурада сақтау қажет). Көлемі 100 мл-лік ыдыста 0,48 г лимон қышқылы, 1,42 г натрий цитраты және 1,47г глюкозаны дистилденген суда ерітеді.

А реагенті (+40С температурада сақтау қажет). 10 мМ Трис-НСL, рН=8,0; 320мМ сахароза; 5мМ MgCL2; 1% Тритон Х-100.

В реагенті (бөлме температурасында сақтайды). 400мМ Трис-HCL, рН=8,0; 60мМ ЭТДА, рН=8,0; 150мМ NaCL; 1% SDS.

Перхлоратты натрий ерітіндісі (бөлме температурасында сақтайды). 5М Na-перхлораты.

К протеиназа ерітіндісі (+40С температурада сақтайды). 20мг/мл дистилденген суда дайындайды.

CLA (+40С температурада сақтайды). 24 айн. хлороформды 1 айн. изоамил спиртпен араластырады.

TE буфері (бөлме температурасында сақтайды). 10мМ Трис-HCL, рН=7,5; 1 мМ ЭТДА, рН=8,0.

ДНҚ бөліп алу технологиясы. Құлақ ұлпасынан ядролық ДНҚ бөліп алу технологиясы жетілдірілген перхлораттық әдістемесі арқылы жүргізілді [Гладырь Е.А. және т.б., 2001].

Алынған ұлпа үлгісінің түтікшеге 2-3 мм2 салып, оған 150 мкл В реагентін және 5 мкл К протеиназаны (20 мг/мл) қосып, 8-20 сағат бойы 600С температурада инкубациялайды. Жасушалық лизатқа 0,33 айн. (50 мкл) 5М Na-перхлоратының ерітіндісін қосып араластырады. Одан кейін 1,5 айн. (300 мкл) CLA қосып, 3-5 минут араластырып, 15000 айн/мин центрифугада 5 минут ұстайды. Үстіңгі қабатта түзілген ДНҚ-н ұқыптылықпен аралық қабатпен араластырып

1-сурет – Зерттеу сызбанұсқасы

алмай таза түтікшеге құйып алады. Алынған ДНҚ-ы бар фазаға 2 айн. (600 мкл) 100%-тік этил спиртін ДНҚ-н тұндыру үшін қосады, оны араластырғаннан кейін ДНҚ көпіршіктері түзіледі. Егер ДНҚ көпіршіктері түзілмесе 15000 айн/мин центрифугада 2-3 минут түтікшені қайтадан ұстайды.

Көпіршіктер түзілгеннен кейін сұйықтықтан бөліп алып, оған 0,5-10 мл 70% этанол (-200С температураға дейін салқындатылған) қосып және 5-10 минут бөлме температурасында инкубациялайды. Спиртті бөліп алғаннан кейін көпіршіктерді аударып 20-30 минут бойы бөлме температурасында кептіреді.

Түтікшеде түзілген заттары 50-100 мкл дистильденген сумен немесе ТЕ буферлі ертіндісімен өңделді.

ДНҚ концентрациясын анықтау. ДНҚ концентрациясы 260 нм толқын ұзындығында спектрофотометрдің көмегімен анықталды.

Генодиагностикалау жұмыстары PSQ96MA SYSTEM (Pyrosequenciq AB) автоматты пиросеквенаторда PSQTM96SNP Reagent KitSx96 (40-0023) реагенттерді пайдалану арқылы жүргізілді.

2.2 Зерттеу нәтижелерін статистикалық өңдеуде қолданылған әдістемелер

Пиросеквенирлеуден алынған мәліметтер PSQ96MA SNP software v.2.0. бағдарламасын қолдану нәтижесінде өңделді. Алынған генотиптер Microsoft Еxcel электронды кестесінде жинақталды. Алынған генотиптер матрицасы статистикалық өңдеу нәтижелеріне негіз болды.

Популяция аралық ұқсастық және генетикалық алшақтылық M.Lynch [1991] формуласын қолдану арқылы есептелінді.

Генотиптері анықталған әртүрлі қойлардың селекциялық құндылығы туылған кезіндегі елтірі сапасы «Қаракөл қозыларының сапасын анықтау жөніндегі нұсқауы» [1996] бойынша анықталды.

Генотиптері әртүрлі қозылардың туылған кезінен 2,5 жасар кезіне дейінгі тірілей салмақтары, экстерьерлік ерекшеліктері, негізгі сыртқы дене өлшем-дерін өлшеу арқылы зерттелінді және Е.Я.Борисенко [1967] әдістемесі арқылы тұлға индекстері есептеліп алынды.

Донор ретінде іріктелініп алынған саулықтар қанындағы ФЖГ/ЛГ қатынасы иммуноферменттерді талдауға арналған микростриптік фотометр «Stat Fax 303 Plus» аппаратында анықталды.

Зерттелген қан сарысуы үлгілеріндегі ФЖГ/ЛГ концентрациясы 450 нм толқын ұзындығында көпканалды планшеттік спектрофотометрдің көмегімен есептелінді.

Донор-саулықтарды гормональды препаратпен индукциялау арқылы суперовуляция жасау, эмбриондарын жуу және олардың сапасын анықтау Н.Әлібаев және О.Бекетауовтың [2006] әдістемелері арқылы жүргізілді.

Зерттеу нәтижесінде алынған сандық мәліметтер Н.А.Плохинский [1980] әдістемесі арқылы өңделініп, олардың статистикалық сенімділігін анықтау үшін Фишер және Стьюдент критериясы пайдаланылды.

3 ЗЕРТТЕУ НӘТИЖЕЛЕРІ

3.1 Әртүрлі құйрықты қой тұқымдарын генотиптері бойынша сұрыптау

3.1.1 Гендер аллелінің жиілігі

Қазіргі кезде селекциялық жұмыстардың тиімділігін арттыру ДНҚ- технологияның дамуымен тығыз байланысты.

Зерттеу жұмыстарының негізгі басты бағыттарының бірі – маркерлік аллельдерді анықтау және патогенді прион ақуыздарына төзімді генотиптерді селекциялық топқа іріктеп, мал басын өз төлінен көбейтуде барынша тиімді пайдалану.

Осыған байланысты 3 қой тұқымы және 5 тұқымішілік типтер тобынан жинақталған 208 бас қойларды скрепи ауруына төзімділігі бойынша бағалау жұмыстары жүргізілді.

Қаракөл қой тұқымының 5 популяциясын генодиагностикалау нәтижесінде ең көп таралған бес аллельдің үшеуі – «ARR», «ARQ» және «ARH» осы қой топтарының барлығында кездесетіндігі белгілі болды (1-кесте).

1- кесте — Әртүсті қаракөл қойында PrP генінің кездесу жиілігі

пайыз есебімен

Көрсеткіштер

Әртүсті қаракөл қойлары

қара

көк

бұқар сұры

қазақ сұры

қарақалпақ сұры

барлығы

Қой саны

30

30

30

30

29

149

Алынған ДНҚ үлгісі

60

60

58

60

58

296

Аллельдер:

ARR

38,3±6,3

38,3±6,3

46,5±6,5

61,7±6,3

51,7±6,6

47,3±2,9

ARQ

50,0±6,4

43,3±6,4

39,7±6,4

35,0±6,1

46,6±6,5

42,9±2,9

ARH

11,7±4,1

16,7±4,8

8,6±3,7

3,3±2,3

1,7±1,7

8,4±1,6

AHQ

-

-

-

-

-

-

ARK

-

1,7±1,7

5,2±2,9

-

-

1,4±0,7

Скрепи ауруына төзімді «ARR» аллелінің кездесу жиілігі қаракөл қой тобында орта есеппен 47,3% болды. Ең көп кездесу жиілігі қазақ сұры қой тобында болса (61,7%), ал көк және қара түсті қаракөл қойларында бұл көрсеткіш шамамен 2 еседей (38,3%) төмен немесе 23,4%-ға кем болды.

Бұл салыстырмалы қой топтарындағы «ARR» аллелінің кездесу жиілігінің статистикалық айырмашылығының дәлдігі едәуір болатындығын көрсетеді (Р<0,01). Демек, көк және қара түсті қаракөл қойларының скрепи ауруына қарсы тұру қабілеті басқа сұр типті қазақы қой топтарына қарағанда төмен екендігін растайды. Сондықтан, көк және қара түсті қаракөл қойларының генетикалық төзімділігін арттыру үшін скрепи ауруына төзімді генотиптерді іріктеуде тек ДНҚ-технологиялық әдістемелерді кеңінен қолдану арқылы шешуге болады және селекциялық жұмыстарды тиімді жүргізуге мүмкіндік береді. 1-ші кесте мәліметінен тағы бір қызғылықты ғылыми деректі айтпай кету мүмкін емес. Қара түсті қойларда жабайы типті «ARQ» аллелінің кездесу жиілігі 50,0% құраса, ең аз пайызы (35,0%) сұр түсті қазақы қой тобы арасында болатындығын зерттеу нәтижесі көрсетті. Сонымен қатар, еуропа малдарында өте сирек кездесетін «ARK» аллелі бұқар сұры қой тобында көптеу (5,2%) және көк түсті қаракөл қойларында аздау (1,7%) болатындығы анықталды.

Атырау және қазақы құйрықты қой тұқымдарын генодиагностикалау нәтижесінде анықталған гендер аллелінің жиілігі бірдей еместігін байқауға болады (2-кесте). Мысалы, өнімі елтірілі-етті-майлы бағытындағы атырау қой тұқымында небәрі 2 аллель «ARR» және «ARQ» диагностикаланған.

2-кесте – Атырау және қазақтың құйрықты қой тұқымында гендер аллелінің

кездесу жиілігі

пайыз есебімен

Көрсеткіштер

Қой тұқымдары

атырау қойы

қазақтың құйрықты қойы

барлығы

Қой саны

30

29

59



Страницы: Первая | 1 | 2 | 3 | ... | Вперед → | Последняя | Весь текст


Предыдущий:

Следующий: